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过 通过 dsRNA 注射的 RNAi 效率通过敲低秋季 Webworm， ，Hyphantria cunea （鳞翅目：Arctiidae ）中的 dsRNA 核酸酶来增强
抽象 RNA 干扰（RNAi）技术是一种用于害虫防治的有前途的方法。RNAi 的效率在不同昆虫物种之间差异很大，越来越多的证据表明，在摄取前双链 RNA（dsRNA）的降解是限制 RNAAi 在昆虫中效率的重要因素。我们最近对中国重要的入侵性害虫秋网虫（Hyphantria cunea）的研究显示，通过 dsRNA 注射对 RNAi 的沉默效率相对较低，这被认为是诱导 RNAi 的最可行的 dsRNA递送方法，并且参与其机制的因素尚不清楚。本文首先在离体测定中检测了 Cunea 的血淋巴和肠道含量中的 dsRNA 降解活性，并观察到 dsRNA 的快速降解，特别是在血淋巴中，仅在 10 分钟内完成。为了确定 dsRNA 降解是否会导致 RNAi 在 Cunea 中的 低有效性，通过同源性搜索对 Cunea 转录组数据库进行同源性搜索，鉴定了 4 个 dsRNA 核酸酶（dsRNase）基因，HcdsRNase1，HcdsRNase2 ， HcdsRNase3 和 HcdsRNase4，并随后在不同的组织，发育阶段和 dsRNA 注射后研究了它们的转录水平。结果表明，HcdsRNases 主要在肠道组织和血淋巴中高度表达， 并且通过 dsGFP 诱导显着上调 HcdsRNase3 和HcdsRNase4 的表达。使用 HcCht5 作为报告基因的 RNAi 研究表明，沉默 HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 通过 dsHcCht5 注射显着增加 RNAi 功效，并且共沉默这两个 HcdsRNase 基因导致疗效的更显着改善。这些结果证实，通过 dsRNA 注射在 猪笼草中的 RNAi 疗效肯定会受到 dsRNase 活性的损害，并且阻断 HcdsRNases 可能会改善 RNAi，为 RNAi 效率低下的昆虫的相关研究提供参考。
关键字：
dsRNase;dsRNA 降解; 核糖核酸干扰;RNAi 效率; 葫芦属
1. 引言 秋季蛛网虫（Hyphantria cunea）是一种属于 Arctiidae 家族的鳞翅目昆虫，是一种起源于北美的全球森林害虫[1]。自 1979年在中国首次报道以来，它已造成严重的经济和生态破坏[2，3]。在生态学上，由于其高繁殖力和增强的生存能力，这种害虫具有极强的竞争力，对生物多样性构成威胁[4]。虽然已经开发了各种控制策略，如自然捕食、微生物干预和杀虫剂，以减轻 葫芦造成的损害[5，6]，但有效控制这种害虫一直很困难。因此，迫切需要开发一种高效且环保的方法来控制 猪笼草 。
由双链 RNA（dsRNA）介导的基因沉默在转录后以序列特异性方式抑制基因表达[7，8]。RNAi 技术正在成为基因功能研究最有前途的工具之一，也是该领域害虫管理的手段[9，10，11]。然而，RNAi 在昆虫中沉默基因的效率因目标分类群而异，并且鳞翅目物种已被证明对 RNAi 特别顽固[12，13，14]。一般而言，dsRNA 在注射而不是通过喂养给药时更可能引发 RNAi 反应[15，16]。然而，与其他鳞翅目动物相比，通过 dsRNA 注射在 Cunea 中很难实现有效的 RNAi 响应：例如，Maruca vitrata需要 1μg IIS（胰岛素/胰岛素样生长因子信号传导）基因的 dsRNA，Heortia vitessoides 需要 3μgTPS（海藻糖-6-磷酸合酶）基因的 dsRNA，S. litura 需要 CHS（甲壳素合酶）基因的 5μgdsRNA， 而 Cunea 嗜血杆菌 需要注射 10μgdsRNA 才能有效沉默甲壳素脱乙酰酶（CDA）基因[17 ，18，19，20]。我们之前的工作还表明，通过 dsRNA 注射的 RNAi 对 H. cunea 幼虫有相当适度的影响。靶几丁质酶 5（HcCht5）基因在注射不同浓度的 dsHcCht5 后维持约 50%的表达[21]。我们也未能通过喂养基因特异性 dsRNA（未发表的数据）来诱导幼虫中的 RNAi。这种低 RNAi 在 猪笼草 中的响应严重阻碍了基于 RNAi 的害虫防治的应用。
已经提出了许多影响 RNAi 效率的因素或分子机制，例如内体卡压、核心机制功能障碍、局限性全身扩散以及昆虫体液中存在 dsRNA 核酸酶（dsRNase）[10，12，22]。最近，dsRNases 因其在 dsRNA 降解中的独有能力而日益被视为导致 RNAi效率有限的主要因素[23，24，25]。昆虫 dsRNase 首先在家用丝蛾（Bombyx mori）的中肠液中被鉴定出来，并含有信号肽和
非特异性内切酶（NUC）结构域[26]。离体实验表明，dsRNase 活性根据昆虫的顺序而变化。在鞘翅目昆虫中，dsRNase 基因主要在肠道中表达[15，27，28]，而在半翅目昆虫中，dsRNase 在唾液中具有活性，但在肠道或血淋巴中不活跃[29，30]。相比之下，鳞翅目昆虫的血淋巴或肠道中的 dsRNA 降解比其他目昆虫的发生速度快得多，例如 Heliothis virescens 和 Spodoptera frugiperda 中的 dsRNase[8，24，31，32]。dsRNase 表达的敲低可大大提高几种昆虫的 RNAi 疗效，包括 Btrotracera tryoni，Leptinotarsa decemlineata 和 Nezara viridula [33，34，35]，证明 dsRNases 确实是 RNAi 疗效有限的原因。到目前为止，很少有研究能够描述 H. cunea 中的 dsRNases。考虑到 dsRNases 在 dsRNA 降解中的重要性及其对改变 RNAi 效率的影响，有必要确定 H. cunea 中的 dsRNases 是否是其对 RNAi 敏感性较低的原因。
在目前的研究中，首先，在离体测定中检测到 dsRNA 在 H. cunea 的血淋巴和肠道含量中的稳定性。然后，我们鉴定并表征了四个 HcdsRNase 基因，并研究了它们在不同组织，发育阶段和 dsRNA 注射后的表达谱。然后进行“RNAi-of-RNAi”注射测定以确定 HcdsRNases 对 RNAi 疗效的贡献。我们发现，分别沉默两种 dsRNases，HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 ， 可以提高 RNAi 效率，共沉默取得了增强的显着促进作用，这表明这两种 dsRNas 酶主要促成了在 Cunea 中 观察到的 RNAi 顽固性。这些结果可以更好地了解秋季网虫对 RNAi 的低敏感性。
2. 结果 2.1. 凝血杆菌的血淋巴和肠道含量均迅速降解 dsRNA 为了评估 dsRNA 在血淋巴和肠道含量中的稳定性，将 3μgdsGFP 与未稀释的提取物在 30°C 下孵育，琼脂糖凝胶在 10 m，0.5，1，2，3 和 4 h 处检测 dsGFP 的稳定性。我们发现肠道内容物的降解在 10 分钟后变得可见，并在 2 小时时完成（图 图 1C）。令人惊讶的是，血淋巴的降解甚至更快，因此 dsGFP 在未稀释的血淋巴中仅在 10 分钟内完全降解（图 图 S1）。为了更好地评估dsRNA 在血淋巴中的稳定性，我们设置了更早和更密集的时间点（2，5，10 和 20 分钟）来检查未稀释的血淋巴中 dsGFP 的降解。结果表明，dsGFP 在 5 min 时大部分降解，10 min 时完全降解（图 图 1A）。然后，分别检测 dsGFP 在稀释肠道含量（10×）和稀释血淋巴（50×）中的稳定性。我们发现 dsGFP 在 2 小时内被 10 倍稀释的肠道内容物完全降解，在 3 小时内被 50 倍稀释的血淋巴完全降解（图 图 1B，D）。这些结果表明 dsRNA 在 H. cunea 的血淋巴和肠道含量中极不稳定。
图 图 1.代表性凝胶图像显示，dsRNA 在（A，C）未稀释或（B，D）稀释的血淋巴和肠道内容物中迅速降解，这些血液和肠道内容物是从 2 天大的五龄幼虫中收集的。在 60μL 组织提取物（血淋巴或肠道内容物）或无核酸酶水（对照）中孵育不同时间段后，通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测 dsGFP 的相对稳定性。m， 分钟;h，小时。
2.2. 来自 Cunea 的 4 个 HcdsRNase 基因的鉴定和表征
对编码 dsRNases 的 基因进行了全基因组鉴定。通过检索 Cunea 的 转录组数据，检索了 4 个编码 HcdsRNase1 ，HcdsRNase2 ， HcdsRNase3 和 HcdsRNa4 的核苷酸序列，属于 dsRNase 亚家族。在这些序列中，三个基因（HcdsRNase2 ，HcdsRNase3 和 HcdsRNase4）的完整开放阅读框（ORF）由 ORF 查找器（鉴定，并通过 NCBI 非冗余蛋白质数据库的 BLASTX搜索进行验证。进行 RACE 以获得 HcdsRNase1 的全长 cDNA 序列。所有编码从 Cunea 猪笼草 鉴定出的 NUC 超家族成员的HCdsRNase 基因均通过克隆和测序完整的 ORF 得到确认。
根据推导的氨基酸序列， 发现 HcdsRNases 的范围在 329-446 个氨基酸范围内，分子量范围为 37.64 至 50.56 kDa（表 表1）。预测的 pI 值从 6.51 到 9.25 不等（表 表 1）。所有蛋白质都含有包含 16-25 个氨基酸残基的信号肽，这表明它们是由细胞分泌的，并且可能在体内执行一些细胞外功能（表 表 1，图 图 2A）。所有基因的序列都含有 NUC 结构域，如 BLASP 或 Pfam 匹配所示（表 表 1，图 图 2A）。多种氨基酸序列比对表明，在 Cunea NUC 蛋白中，与活性位点、底物结合位点和镁离子结合位点相对应的关键氨基酸残基是保守的（图 图 2B）。通过检索 Cunea 的基因组数据库（GenBank 加入：PKRV000000000.1），我们获得了所有四个 HcdsRNases 的基因组区域，并进一步分析了外显子和内含子的组织结构。
发现 HcdsRNase1，HcdsRNase3 和HcdsRNase4 含有七个外显子，HcdsRNase2 含有六个外显子（图 图 2C）。HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 彼此表现出最高的氨基酸身份（82.29%）。HcdsRNase1 分别显示出 70.49%和 68.30%的氨基酸身份，HcdsRNase3 和 HcdsRNase4。HcdsRNase2与其他 HcdsRNases 的相位较低，为 31.83–34.11%（表 表 2）。
图 图 2.推导 HCDsRNases 的氨基酸序列分析和基因结构分析。（A）HcdsRNases 的排列氨基酸序列中的结构域排列。红色箭头表示信号肽的位置，橙色框表示核酸内切酶 NS 结构域，灰线表示氨基酸链。（B）推导的 HcdsRNase 蛋白的多序列比对。以
黑色和灰色突出显示的残留物分别是保守的和相似的。信号肽带有下划线。活性位点由三角形标记，Mg 2+ 由星形结合位点结合，底物由圆圈结合位点组成。（C）HcdsRNases 的基因结构。正方形和线条分别表示单个 HcdsRNase 基因中的外显子和内含子。
表 表 1.来自 H. cunea 的 NUC 蛋白的性质。
表 表 2.HcdsRNase 蛋白序列中 Cunea 的鉴定 。
使用 30 个假定的昆虫 dsRNase 序列，8 个真核内切酶 G 序列和 3 个细菌 DNA / RNA 非特异性核酸酶序列构建系统发育树（图 图 S2）。从属于 6 种不同主要昆虫目（直翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目和半翅目）的 18 种不同昆虫物种中检索了推定的昆虫 dsRNase 序列数据，显示出广泛的分类分布。HcdsRNase 蛋白是昆虫中的 dsRNase 同源物。HcdsRNase1，HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 聚集在主要的鳞翅目分支中，HcdsRNase2 与半翅目分支聚集在一起（图 图 S2）。
四个HcdsRNase基因的氨基酸序列沉积在NCBI数据库中，可以根据以下加入编号进行访问：MZ981769 （HcdsRNase1），MZ981770（HcdsRNase2），MZ981771（HcdsRNase3）和 MZ981772（HcdsRNase4）。
HcdsRNase 基因在 Cunea 幼虫的所有幼虫中表达，主要在肠道和血淋巴组织中起作用
为了研究 4 种 HcdsRNases 的发育阶段特异性表达，通过 RT-qPCR 监测从第一龄到第五龄（L1-L5）的第 3 天幼虫的mRNA 表达水平。所有四个 HcdsRNase 基因都被检测到在所有幼虫中表达。HcdsRNase1 在第一和第五龄中表现出高表达，HcdsRNase2，HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 在早期（L1 和 L2）显示出低转录本水平，在第三至第五龄（L3 至 L5）中表现出高水平（图 图 3A）。
图 图 3.四个 HcdsRNase 基因在 H. cunea 中的表达谱。（A）HcdsRNases 在不同发育阶段的 相对 表达水平。从每个幼虫体育场的 3 天龄幼虫（L1-L5）中分离的总 RNA 制备 cDNA 模板。（B）HcdsRNases 在 H. cunea 中不同组织或身体部位的相对表达水平。从 2 日龄的五龄幼虫中分离出的总 RNA 制备 cDNA 模板，解剖头部，内脏，脂肪体，外皮和血淋巴。β- 肌动蛋白 被用作参考基因。值是三个重复± SE 的均值。列上不同的字母表示显著差异（p < 0.05）。ND 表示不可检测的表达式。
为了研究不同组织中 HcdsRNases 的相对转录水平，从五龄 Cunea 幼虫的头部，肠道，脂肪体，外皮和中肠组织中分离出总 RNA。结果显示，除 HcdsRNase1 的情况外，在所有检查的组织中都可以检测到 HcdsRNases 的表达，该酶未被发现在外皮和血淋巴中表达。请注意，所有 HcdsRNases 在头部表现出低表达，在肠道中表现出显着高表达，特别是 HcdsRNase3 和HcdsRNase4。其中三种，HcdsRNase2 ， 3 和 4，在血淋巴中也高度表达（图 图 3B）。总体而言，HcdsRNases 在 Cunea 的各种组织中表现出广泛的表达，并且主要在肠道和血淋巴中表现出功能性。
2.4. dsRNA 注射液可诱导 HCdsRNase3 和 HcdsRNase4 的表达
为了了解 dsRNA 注射对 HcdsRNases 表达水平的影响，我们研究了 dsGFP 注射后 HcdsRNases 的短期转录反应。向 2日龄的四龄幼虫注射 dsGFP，并在治疗后 24 和 48 h 通过 RT-qPCR 检测 4 个 HcdsRNase 基因的表达水平。我们发现HcdsRNase1 和 HcdsRNase2 在 24 和 48 h 的表达没有显着差异。然而，与对照组相比，DsGFP 处理的组在 24 和 48 小时时HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 的表达量显着高（图 图 4A，B）。进一步的组织表达检测表明，这两种 HcdsRNases 主要在肠道组织中上调（图 图 S3）。这些结果表明，dsRNA 注射可以上调 HcdsRNase3 和 HcdsRNase4 的表达水平。
图 图 4.dsGFP 注射后 4 个 HcdsRNase 基因在（A）24 h 和（B）48 h 时的相对 mRNA 表达水平。向 2 日龄的四龄幼虫注射 2 μL 6 μg dsGFP（处理组为黑柱）或 2 μL DEPC 水（灰色柱，对照组）。误差线表示基于四个重复的计算均值的标准误差。* 星号表示差异显著（p < 0.05）。NS 意味着没有显著差异。
2.5. HcdsRNase 基因可以通过注射相应的 dsRNA 来有效沉默
为了评价 HCdsRNases 的沉默是否可以提高 猪笼草 的 RNAi 疗效，首先通过单独注射 dsRNase 特异性 dsRNA（ dsdsRNase ）来对四个 HcdsRNase 基因进行 RNAi 沉默。处理后 48 h 检测 HcdsRNase 基因的表达水平。结果表明，4 种HcdsRNases 被相应的 dsRNA 成功沉默，并且没有发生脱靶效应（图 图 5A-D）。因此，dsdsRNase 注射液可以有效地下调凝血杆菌中相应的 HcdsRNase 基因表达水平。
图 图 5.（A）HcdsRNase1，（B）HcdsRNase2，（C）HcdsRNase3 和（D）HcdsRNase4 注...
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