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六种家畜乳氨基酸特征聚类分析
我国牛羊乳业高速发展的同时，马、骆驼、牦牛和水牛等家畜乳也得到区域性开发。特种家畜乳因风味独特、营养价值高和产量低等特点，极易被低价位牛羊乳或其他原料掺假或冒充，破坏乳的完整性、真实性及功能属性[1]。不仅侵害消费者健康和尊严，也破坏正常市场竞争秩序，更不利于民族和地区特种家畜乳业健康发展[2]。乳是人类膳食蛋白质及氨基酸(aminoacids，AA)的重要来源，哪种乳蛋白更接近人 体 ， 尤 其 是 哪 种 乳 更 符 合 婴 幼 儿 的 必 需 氨 基 酸(essentialaminoacid，EAA)模式，成为亟待解决的重要问题。随着化学计量学及食品组学大数据检测分析技术的不断发展，各种家畜乳 AA 特征及营养价值的微妙差异应该重新探讨、认识和评价。
乳蛋白质和肽存在物种特异性，可用于乳的物种来源真实性判别。吴亚君等[3]利用毛细管电泳技术比较了牛和羊乳蛋白电泳图谱，发现牛和羊乳的电泳图谱存在差异。马露[4]报道了马、山羊、驼和牦牛 4 种家畜乳蛋白的反相高效液相色谱图存在种属特异性，利用其图谱可以很好地区分乳的物种来源。EL-HATMI 等[5]通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术比较了牛、山羊、驴、骆驼和人乳乳清蛋白的电泳图谱，发现可判别乳样的物种真实性。但不同动物乳蛋白质或肽水解获得的 AA，是否还存在物种或其他分类特异性，这种特异性是否
可以实现特种家畜乳完整性和真实性判别，有待进一步研究。乌恩其[6]以组织液中的免疫球蛋白 G(immunoglobulinG，IgG)为目标物种特异蛋白，建立用经典免疫学方法检验牛、羊和骆驼肉中掺假的马肉、鸭肉和猪肉等；乳中也含 IgG，因此以 IgG 为目标蛋白也可检测高价格特种家畜乳中掺假牛乳。近些年有研究开始借助化学计量学研究食品营养素组或营养素指纹，如氨基酸指纹、脂肪酸指纹与物种特异性及其他决定和影响因素的关系模型。郭军等[2]提出了以脂肪酸和氨基酸指纹进行原奶和液态乳真实性的鉴别方法。吕中旺等[7]对牛、山羊、水牛和牦牛 4 种家畜乳 AA 进行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)，发现不同家畜乳有分离趋势，但未进行建模验证。郭珍琪[8]和张鑫等[9]利用化学计量学研究不同家畜乳的脂肪酸组成，发现家畜乳的脂肪酸构成存在显著的物种差异，同时也发现脂肪酸构成也与饲养模式及加工等分类因素有关。SMIDDY 等[10]利用牛、水牛、绵羊、山羊、驴、马和驼乳的甘油三酯做 PCA，结果显示家畜乳在得分向量图中明显分离，且聚类特征符合物种分类学规律，刘宇婷等[11]也印证了同样的结果。
传统描述性统计和差异检验的基本数学原理和构架基于单变量和数据的线性规律，无法对多指标、向量、矩阵等大数据进行分析。多变量统计学和化学计量学的发展为解析和挖掘数据串、数据矩阵等大数据结构和隐藏的规律模式、利用
食物大数据描绘和分类食物提供了无限的可能[2]。本研究旨在利用现代化学计量学聚类和判别分析手段，探索和比较牛乳和特种家畜乳 AA 整体特征，同时相对于人乳必需氨基酸模式，利用新的策略和手段筛选 AA 更接近人乳的乳种类，以期为乳及乳制品数据库的健全、特种家畜乳的开发与利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 乳样 样 从内蒙古、四川和广西地区采集代表性乳样 5 55 份。其中荷斯坦牛(牛)乳 15 份，采自内蒙古巴彦淖尔和呼伦贝尔；蒙古马乳 15 份，采自内蒙古呼伦贝尔、锡林郭勒和鄂尔多斯；驼乳 10 份，采自内蒙古阿拉善和呼伦贝尔；山羊乳 5 份，采自内蒙古鄂尔多斯；牦牛乳 5 份，采自四川红原地区；水牛乳 5 份，采自广西南宁。样品采集后分装于离心管，密封并用液氮迅速冷却，冻藏于-20℃冰柜备用。样品置室温解冻后，均质取样用于 AA 的测定。每个乳样 2 次平行测定的AA 值都用于聚类分析。
1.1.2 药品试剂 17 种 AA 混合标准品，美国 Sigma； 公司； CDAA- - 270019- - 200mgL- -色氨酸，上海安谱实验科技有限责任公司；浓盐酸( ( 优级纯) ) ，国药化学试剂有限公司；甲醇( ( 色谱纯) ) 、冰乙酸、异丙醇( ( 色
谱纯) ) 、氢氧化钠( ( 优级纯) ) ，麦克林化学试剂有限公司；茚三酮、钾钠缓冲液、 BUFFERA A- -1 1 、 BUFFERB- -1 1 、再生液，赛卡姆( ( 北京) ) 科学仪器有限公司。
1.1.3 仪器设备 S S- -D 433D 全自动氨基酸分析仪，德国赛卡姆公司；0 HN200 多功能氮吹仪，海能仪器。
1.2 实验方法 1.2.1 氨基酸测定 参照 GB5009.124 —2 2022 酸水解法测定 7 17 种 种 AA( 除色氨酸) ) ，参照 GB/T15400 —2 2022 碱水解法测定色氨酸。每个样品做 2个平行，使用 S-433D 全自动氨基酸分析仪进行测定。色谱条件：使用水解氨基酸分析柱 LCAK06/Na(4.6mm×150mm)；柱温 58～74℃梯度控温；反应温度 130℃；流动相流速0.45mL/min；茚三酮流速 0.25mL/min；检测器 440nm/570nm双波长检测器；进样体积 50μL。
1.2.2 统计分析 本研究乳样 2 2 轮测定都直接用于分析，即 5 55 份乳样，进行 2 2轮平行 A AA 测定，获得 0 110 组数据，进行数据整理和质量检验，剔除了 4 4 组界外数据，有 6 106 组数据用于描述性统计和后续的聚类分析。平行测定数据纳入聚类分析，等同于引入和观察测定变异的影响，可增加模型稳健度。
以 联 合 国 粮 农 组 织 / / 世 界 卫 生 组 织
(FoodandAgricultureOrganizationoftheU nitedNations/WorldHealthOrganization， ，2 FAO/WHO)2022 发布的 5 935 号报告中的混合人乳 A AA 数据进行参照和比较研究 [12] 。
A EAA 为 模式以色氨酸含量为 1 1 他 分别计算其他 A EAA 相应的比值[13] 。
用 用 IBM- -0 SPSS20.0 进行描述性统计和差异检验，对 6 6 种家畜乳 乳 8 18 种 种 A AA 绝对含量、百分含量和 A EAA 模式数据的整体差异种 均进行配伍方差分析，每种 A AA 绝对含量和百分含量在物种间的差异做单因素方差分析，结果用表示。用化学计量学软件 Pirouette4.5(美国 Infometrix 公司)对 AA 百分含量及EAA 模式数据分别进行 PCA，观察乳样的自然聚类特性，探讨以 AA 建模判别乳的物种真实性的可行性，以及判断哪种家畜乳 AA 或 EAA 更接近人乳。并利用 AA 百分含量建立软独立建模分类(softindependentmodelingofclassanalogies，SIMCA)判别模型，对被检乳样及人乳数据进行有监督的分类/判别分析。SIMCA 模型内部验证：用所有 55 份乳样 2 个 AA平行测定值(剔除 4 个异常值，即 106 组数据)进行建模，再对建模乳样物种进行鉴定(软件可自动完成)；SIMCA 模型外部验证：人工随机抽出 10～12 组数据，用其余 94～96 组数据建模，对抽出的样本数据进行判别；这种随机组合建模验证重复 20 次；人乳数据不参与建模，仅用于判别。累计验证样本 221 组。
2 结果与分析 2.1 六种家畜乳氨基酸特征 6 6 种家畜和人乳 A AA 绝对含量 (mg/g) 描述性统计结果见表 1 1 ，A AA 百分含量 [AA/ 总氨基酸 (totalaminoacid， ， TAA),%] 统计结果见表 2 2 ，A PCA 结果见图 1 1 。
2.1.1 氨基酸绝对含量特征 6 6 种家畜乳 A AA 配伍方差分析整体差异极显著 (P0.01) ，每一种氨基酸在物种间均有差异。TAA(相当于总蛋白)含量由高到低依次为：牦牛和水牛乳(差异不显著)、山羊乳和驼乳(差异不显著)、牛乳和马乳。家畜乳 TAA 含量均高于人乳，其中牦牛乳 TAA 含量约为人乳的 5.4 倍；马乳最稀薄，TAA 约为人乳的 1.7 倍。6 种家畜乳 EAA/TAA 均达 41.75%以上，EAA/NEAA 均达 71.86%以上，都符合并高于 FAO/WHO 理想蛋白相应指标 40%和 60%的标准[12]；计算 FAO/WHO 公布混合人 乳 EAA/TAA 为 42.96% ， EAA/ 非 必 需 氨 基 酸(nonessentialaminoacid,NEAA)NEAA 为 75.32%。
6 6 种家畜乳 EAA 中含量最高的为 Leu ，其次为 Lys 和 Val； ； NEAA含量最高的为 Glu ，其次为 o Pro 和 和 Asp ；牦牛乳中 Leu、 、 Phe 、His 、 Lys 、 Gly 、a Ala 和 和 g Arg 含量显著或极显著的高于其他 5 5种家畜乳。水牛乳中 Thr、Asp、Glu、Cys 和 Tyr 含量显著或极显著高于其他 5 种家畜乳。山羊乳中 Trp 含量显著高于其他 5 种家畜乳。
表 1 六种家畜乳和人乳 AA 含量单位：mg/g 乳样 Table1Aminoacidinsixanimalsmilkandhumanmilk 注：*表示 FAO/WHO 公布的混合人乳数据[12](下同)，每一种 AA 做单因素方差分析，不同小写字母表示差异显著或极显著，6 种家畜乳以 AA 均值做配伍方差分析(下同)，TAA 值行标注不同大写字母表示差异极显著(P0.01) 2.1.2 氨基酸百分含量特征 6 6 种家畜乳和人乳 AA% 结果统计见表 2 2 。对 AA%均值的配伍方差分析，物种间无显著差异(P=1.000)，而在 PCA 和 SIMCA分析均清晰显示家畜乳以 AA 构成聚类符合物种分类学规律，说明传统统计对 AA%整体差异不敏感。
牛乳中 Lys% 含量显著高于其他 5 5 ； 种家畜乳； Leu% 显著高于马、山羊、 牦牛和水牛乳，与驼乳无显著差异。牦牛乳中 Pro%显著高于驼乳、山羊乳、水牛乳、牛乳和马乳。水牛乳中 Glu%显著高于其他 5 种家畜乳。山羊乳中 Thr%、Val%、Phe%和Trp%显著高于其他家畜乳，其中 Trp%约为其他 5 种家畜乳的1.2～1.5 倍，牛乳含量最高，驼乳和马乳次之，牦牛乳最低。驼乳中Met%、IIe%和Leu%含量高于其他家畜乳。马乳中His%、Asp%、Ala%和 Arg%显著高于其他 5 种家畜乳，Ser%显著高于水牛、牛和牦牛乳，与山羊乳无显著差异。人乳中 Trp%、Gly%、Cys%和 Tyr%高于 6 种家畜乳。
表 2 六种家畜和人乳氨基酸百分含量(氨基酸/总氨基酸)单
位:% Table2Aminoacidspercentageofsixanimalsandhumanmilk(AA/TAA) 注：物种间无显著差异(P=1.000) 家畜乳和人乳 AA%的 的 A PCA 结果见图 1 1- -a a。
。6 种家畜乳样在三维空间自然聚类的距离远近符合物种分类学规律。牛、牦牛、水牛和山羊乳 4 种牛科聚类同一区域(主因子 1 和主因子 2相区)，而马乳和驼乳分布在另外 2 个区域：同属偶蹄类的驼乳样品在主因子 1 轴下侧与牛科动物对应，但距离较远；马乳分布在偶蹄类对面，距离较远。人乳空间投射点距家畜乳聚类群较远，相对而言人乳与马乳最接近，说明不同物种乳样的 AA 特征存在显著差异。主因子 1 集合的 AA 共性(聚类贡献)仅为 44.6%，而主因子 2 和 3 分别为 16.9%和 10.3%，说明动物乳中 AA 间的相关性并不大。
由图 1 1- -b b 可知不同乳样的特征氨基酸，人乳为 Trp、 、 Cys、 、 Asp和 和 Arg ，马乳为 a Ala 和 和 His ，驼乳为 e Ile 和 和 Leu ，山羊乳为r Ser 和 和 Phe ，牛乳为 Lys ，牦牛乳为 Pro ，水牛乳为 Glu ，与AA% 的描述性统计结果基本一致。
2.2 六种家畜乳必需氨基酸模式分析 6 6 种家畜乳和人乳 A EAA 模式值统计结果见表 3 3 ，所有乳样 EAA模式值的 A PCA 结果见图 2 2 。6 种家畜和 FAO/WHO 发布的混合人乳 EAA 模式值均值配伍方差分析差异极显著(P0.01)。家
畜乳 EAA 中含硫氨酸(Met+Cys)模式值最接近人乳，其他 EAA值均高于人乳。从 EAA 模式值的总均值来看，山羊(4.57)和马乳(4.63)最接近人乳(3.14)，其他动物乳 EAA 模式值均值为人乳的 1.8～2.2 倍。
a-得分向量图；b-根向量图 图 1 六种家畜和人乳氨基酸 PCA Fig.1PCAofaminoacidsofdifferentspeciemilk A EAA 模式值 A PCA 结果显示，6 6 种家畜乳相对集中，与人乳距离远，说明人乳 A EAA 模式与动物乳差异大。主因子 1 集合了EAA 共性为 89.9%，说明 EAA 相关性较大，而主因子 2 仅聚集了 7.8%的 EAA 共性。在主因子 1 轴上，山羊乳、马乳与人乳分布距离最接近，其次是牛乳、驼乳、水牛乳和牦牛乳，与 EAA 模式的配伍方差分析结果一致，也与 EAA 模式值的总均值分析结果一致。显然 PCA 结果更直观。
6 6 种家畜乳和人乳中9 9 种 EAA 的构成比例由高到低依次为 Leu 、Phe+Tyr 、 Lys 、 Val 、 Ile 、T T hr 、s His 和含硫氨酸，其中含量较少的 A EAA 有 有 p Trp 和含硫氨酸，属于限制性 AA 。
表 3 六种家畜乳和人乳的氨基酸模式 Table3Aminoacidpatternsinsixlivestockmilkandhumanmilk 注：对乳样的 EAA 模式进行配伍方差分析，同行不同小写字母间差异极显著(P0.01)
图 2 六种家畜乳和人乳的氨基酸模式 PCA Fig.2PCAofaminoacidpatternsinsixlivestockmilkandhumanmilk 2.3 六种家畜乳 SMICA 模型的建立及判别 家畜乳 A AA 构成和 A EAA 模式的 A PCA 均证明家畜乳 A AA 构成存在显著的物种特异性，乳样的自然聚类符合这些哺乳动物物种分类学亲缘关系。但 PCA 实际上不是分类和判别分析的专用工具，因此本研究进一步利用家畜乳 AA%数据建立了 SIMCA判别模型(图 3)，对 6 种家畜乳进行有监督的聚类分析，物种判别模型效果见图 3-a。6 种家畜乳样在 SIMCA 模型图中的聚类符合物种亲缘远近。牛、牦牛、水牛和山羊乳 4 种牛科家畜乳的云图分布于同一相区，共同聚类于三维图右上方；同为偶蹄类的驼乳聚集在 PC1 轴对面，但与牛科动物聚类很远。而马属动物的蒙古马乳聚类云出现在三维图左侧(PC1 轴负值侧)，与偶蹄类对应，距离较远。总之，SIMCA 结果与PCA 一致，但作为有监督的聚类和判别分析方法，SIMCA 的效果更好。
a-牛乳、马乳、驼乳、山羊乳、牦牛乳、水牛乳；b-人乳 图 3 不同物种乳样氨基酸的 SIMCA 模型 Fig.3AminoacidfingerprintSIMCAmodelofmilksamplesofdifferentspecies SIMCA 模型内部验证和外部验证的样本集及验证结果见表4 4 。
用 55 份乳样平行测定结果建立的模型逐一对每个样品判别，即内部验...
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