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黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在黑曲霉中的同源表达
脂肪酶 (EC3.1.1.3,lipase) 又称为三酰基甘油水解酶，是一类重要的水解酶，可催化酯水解、酯化和酯交换等反应 [1- - 3] 。脂肪酶普遍存在于自然界中，在植物、动物和微生物中均有发现[4]。目前脂肪酶的工业化生产主要利用微生物发酵[5-6]。脂肪酶在两相界面、水性介质或有机相体系中均能进行催化反应，是工业生产应用的关键酶，在生物柴油、食品、化妆品、皮革、纺织、洗涤业和制药等领域具有良好的应用前景[7-8]。
黑曲霉作为外源蛋白表达宿主，具有优异的蛋白分泌能力、准确的翻译后加工能力以及出色的遗传稳定性，同时具有良好的安全性。黑曲霉表达系统在表达重组蛋白领域具有巨大潜力，逐渐成为蛋白工厂[9-10]。黑曲霉脂肪酶多为胞外酶，因此不仅可以利用液体培养基进行发酵，还能采用低成本的固体培养基进行生产。朱思远[11]通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶的表达量，开展了 CRISPR/Cas9 技术在黑曲霉表达系统中的应用，构建了尿嘧啶缺陷型菌株。但是近年来对于微生物资源的开发利用率相对较低，仅在 1%左右[12]。脂肪酶在工业化生产中也面临着生产效率不高的问题，因此探索提高脂肪酶产量和活力的方法是当前研究的热点[13-14]。
本研究利用生物学信息库进行信息分析和对比，对黑曲霉基因组中的脂肪酶功能基因进行挖掘和筛选。利用原生质体-PEG 转化法构建黑曲霉工程菌，实现 8 种黑曲霉来源脂肪酶基因的同源表达。通过对表达质粒启动子和信号肽的优化以提高蛋白表达水平，并对重组脂肪酶进行纯化和酶学性质表征。
1 材料与方法 1.1 菌种与质粒 霉 黑 曲 霉 0 (Aspergillusniger)AS3.350 、 、 α E.coliDH5α 、E.coliRosetta(DE3)霉 、黑曲霉 MA粒 、质粒 A pCAMBIA 和质粒pET- - 28a(+) 均为本实验室保存。
1.2 材料与试剂 A DNA 、 聚合酶、限制性内切酶、A DNA 凝胶回收试剂盒，宝日医( ( 北京) ) 生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、片段纯化试剂盒和 和 A RNA 提取试剂盒，北京全式金生物有限公司；一步克隆连接试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.3 黑曲霉脂肪酶基因的生物信息分析 从 从 I NCBI 数据库中查找黑曲霉来源脂肪酶并比对分析后，选取了 8 8 个黑曲霉脂肪酶，目的基因详情见表 1 1 。利用在线工具 MAFFT 对这 8 个脂肪酶的编码序列进行多序列比对，利用在线工具 SignalP4.1 对这 8 个脂肪酶进行信号肽预测等生物信息学分析。
表 1 脂肪酶基因来源和氨基酸信息 Table1Thesourcesoflipasegeneandaminoacidinformation 1.4 黑曲霉脂肪酶基因克隆与表达 黑曲霉 0 AS3.350 总 总 A RNA 、 的提取、A cDNA 的制备与纯化按照试剂和 盒说明书进行，质粒和 R PCR 产 物酶切、连接、热激法转化、原生质体- -G PEG 转化法及转化子筛选等均采用实验室常规方法进行 [15] 。
1.5 黑曲霉工程菌转化质粒的优化 1.5.1 含不同信号肽质粒的构建 分别设计引物 pCAMBIA- -F F 和 和 pCAMBIA- - ScbhΙ- -R R ； pCAMBIA- -F F和 pCAMBIA- - SANL- -R R 以 pCAMBIA- - PgpdA- - SglaA- - H3 为模板扩增。将 含 有 不 同 信 号 肽 的 目 的 基 因 与 载 体 连 接 构 建pCAMBIA-PglaA-ScbhΙ-H3 和 pCAMBIA-PglaA-SANL-H3 重组质粒。将不同质粒转入黑曲霉宿主，通过对酶活力的测定和SDS-PAGE 分析，选择最优的黑曲霉系统表达信号肽。
1.5.2 含不同启动子质粒的构建 设 计 引 物 pCAMBIA- - PglaA- -F F 和 pCAMBIA- - PglaA- -R R 以pCAMBIA- - PgpdA- - SglaA- -3 H3 。
为模板扩增。将 PglaA 启动子与载体连接构建 pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3 重组质粒并转入黑曲霉宿主，通过酶活力的测定和 SDS-PAGE 分析，选择最优的黑曲霉系统表达启动子。
1.6 黑曲霉工程菌的活化与发酵培养
将 将 4℃素 保藏的菌种划线到潮霉素 B B 抗性质量浓度为L 200μg/mL 的 的 A PDA 平板上， 30℃ 培养 4d ，用无菌水冲洗孢子做成孢子悬液，充分振荡 30min。
。按0.8%的接种量接入到75mL液体发酵培养基中，30℃、150r/min 摇床培养 6d。发酵培养基(g/L)：玉米淀粉 50，玉米浆 30，豆粕粉 20。
1.7 黑曲霉脂肪酶的分离与纯化 用 收集发酵培养后的发酵液，用 0 300 目的过滤筛滤去菌丝体，于 将粗酶液于 n 10000r/min 心 离心 10min ，保留上清液，再用m 0.22μm 的微滤膜进行微滤。将粗酶液用镍柱亲和层析树脂纯化，收集纯化的酶液，透析去除高浓度咪唑获得纯化后的酶溶液。
1.8 脂肪酶的酶活力测定方法 利用对硝基苯酚乙酸酯 (pNPA) 作为底物进行脂肪酶酶活力的检测。脂肪酶能够水解 pNPA 产生对硝基苯酚(p-NP)。在pH7.0，40℃条件下，1min 释放 1μmol 的 p-NP 为 1 个酶活力单位。
1.9 黑曲霉脂肪酶的酶学性质表征 1.9.1 酶最适温度及温度稳定性 在不同温度 (25 ～ 60℃)酶 下，通过测定脂肪酶 ANL- -3 H3 催化A pNPA 。
的水解活性来确定酶的最适反应温度。将最适温度条件下的酶活力定义为 100%。将酶溶液分别放置于不同温度(25～60℃)下孵育2h，每隔20min取样检测酶液的水解活性，
观察 ANL-H3 的热稳定性。将放置 0h 酶液的酶活力定义为100%。
1.9.2 酶最适反应 pH 及 pH 稳定性 在不同 H pH 值 (pH5.0 ～ 9.0) 下，使用 A pNPA 作为底物测定脂肪酶 酶 ANL- -3 H3 的水解活性来确定酶的最适 pH 。在 4℃条件下，将酶液分别置于(pH5.0～9.0)的缓冲溶液中 2h，每隔 20min取样测定酶液的水解活性，观察 ANL-H3 的 pH 稳定性。将放置 0h 的酶液的酶活力定义为 100%。各 pH 缓冲体系分别为：50mmol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH5.0～5.5)；50mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH6.0～8.0)；50mmol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.5～9.0)。
1.9.3 酶的催化底物特异性 以不同碳链长度脂肪酸 (C2 ～ C16) 的对硝基苯酚酯为底物，在 在 40℃ ，0 pH7.0 的条件下测水解活性。将最高酶活力定义为100%。
1.9.4 金属离子对酶活性的影响 在酶溶液中分别加入终浓度为 1 1 和 L 5mmol/L 的金属离子 (Na+ 、Mn2+ 、 Ca2+ 、 K+ 、 Mg2+ 、 Cu2+ 、 Fe3+ 、 Ni2+和 和 Zn2+) ，在 4℃放置 1.5h ，随后测定脂肪酶 ANL- -3 H3 催化 A pNPA 的酶活力，以未添加金属离子处理的酶液作 为对照组。计算相对酶活力，将对照组的酶活力定义为 100%。
1.9.5 有机溶剂对酶活性的影响
在标准反应体系中分别加入 5%、 、 10% 的有机溶剂( ( 甲醇、乙腈、丙酮、 DMF 、O DMSO 和四氢呋喃) ) ，在 4℃ 放置 1.5h ，测定脂肪酶 酶 ANL- -3 H3 催化 A pNPA 的酶活力，以不加有机溶剂的酶液作为对照组。计算相对酶活力，将对照组的酶活力定义为 100%。
1.10 黑曲霉脂肪酶的动力学参数测定 在最佳测定条件下，计算黑曲霉脂肪酶 ANL- -3 H3 在不同 pNPA浓度下 (1 ～ 100mmol/L) 的反应初速度。利用软件 Origin8.5非线性拟合(参考 Michaelis-Menten 方程)得到米氏常数 Km和最大反应速率 Vmax。
2 结果与讨论 2.1 黑曲霉脂肪酶基因的克隆及工程菌的构建 利用生物学信息库信息分析和全基因组检索发现结构和功能与已知酶类似的同源酶编码序列和一些未探究的编码片段，对黑曲霉全基因组中脂肪酶功能基因进行挖掘筛选，选取了 8 8 个来源于黑曲霉，分子质量为 20 ～a 40kDa 的黑曲霉脂肪酶基因。以黑曲霉 AS3.350 的 cDNA 为模板，对该 8 个基因进行 PCR 扩增，并命名为 H1～H8。重组质粒 pCAMBIA-H1(-8)转化在黑曲霉 MA 中，获得 H1(-8)重组黑曲霉工程菌，命名为 MA-H1(-8)。
2.2 高活力黑曲霉脂肪酶工程菌的筛选 检测 8 8 个黑曲霉工程菌 MA- - H1(- - 8) 发酵 d 10d 的上清液的脂肪酶活力，结果如图 1 1 所示。转化子 MA-H2 和 MA-H3 的酶活力
较高，最高酶活力分别为 1.37 和 1.41U/mL。分别取重组脂肪酶转化子酶活力最高的发酵上清液进行 SDS-PAGE 分析，MA-H2、MA-H3 的酶活力最高，相应泳道中目的蛋白条带也较粗，说明了这 2 个重组黑曲霉菌株有较高的蛋白表达量，考虑到最高酶活力以及发酵周期长短等因素，最终选择黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 基因作为目标脂肪酶基因进行后续的优化研究。
图 1 黑曲霉工程菌发酵上清液的酶活力情况 Fig.1EnzymeactivityinfermentationsupernatantofA.nigerengineeringstrain 2.3 黑曲霉脂肪酶基因信号肽和启动子的优化 信号肽对蛋白质的外源表达具有非常关键的影响，信号肽连接目的蛋白形成 1 1 个蛋白嵌合体，最终的分泌效率受到其构型、表面电荷分布和分子质量等因素的影响 [16] 。扩增带有cbhΙ 信 号 肽 和 ANL 信 号 肽 的 目 的 基 因 ， 构 建pCAMBIA-PglaA-ScbhΙ-H3 和 pCAMBIA-PglaA-SANL-H3 重组质粒，将质粒片段转入黑曲霉宿主。经酶活力测定，以 glaA、cbhΙ 和 ANL 为信号肽的脂肪酶活力分别为 1.41、1.12 和0.57U/mL。因此选择 glaA 为最优的黑曲霉系统表达信号肽。
霉 以 黑 曲 霉 A cDNA 增 为 模 板 扩 增 A PglaA 启 动 子 ， 构 建pCAMBIA- - PglaA- - SglaA- -3 H3 。
重组质粒。将质粒片段转入黑曲霉宿主，以 PglaA 为启动子的重组工程菌的蛋白表达量更高，
而且其脂肪酶酶活力为 1.68U/mL，比以 PgpdA 为启动子的重组菌的酶活力高，因此选择 PglaA 为最优的黑曲霉系统表达启动子。通过插入基因的修饰以提高黑曲霉脂肪酶表达量的优化实验，最终选择 pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3 重组质粒进行后续实验研究。
2.4 黑曲霉脂肪酶的分离与纯化 利用镍离子亲和层析柱纯化酶蛋白，洗脱下来的蛋白溶液经超滤管 (10kDa) 超滤除盐和浓缩，纯化后脂肪酶的比活力达31.44U/mg为 ，纯化倍数为 5 65.5 倍，但酶活力的回收率较低，仅为 7.84% 。
2.5 黑曲霉脂肪酶的酶学性质 2.5.1 酶最适温度和温度稳定性 在不同的温度下，A A NL- -3 H3 的酶活力变化结果如图 2 2 所示。在25～45℃，ANL-H3 活性随着温度升高逐渐增加，ANL-H3 的最适温度是 45℃。当温度进一步升高，酶活力显著下降。
图 2 温度对黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 活性的影响 Fig.2EffectsoftemperatureontheactivityofANL-H3 进一步测定了 ANL- -3 H3 在不同温度条件下保持 2h 酶残留的活力，以考察其热稳定性，结果如图 3 3 所示。在 25～40℃下，ANL-H3 酶活力基本保持不变；在 45～55℃下的仍可以保持80%以上的酶活力，当酶蛋白在 60℃处理 2h，酶活力开始下降，维持在初始活力的 60%左右，说明 ANL-H3 拥有良好的热
稳定性。在实际应用中，结合最适温度与温度稳定性这 2 个因素，选择 45℃为最适反应温度。
图 3 黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 的温度稳定性 Fig.3ThethermalstabilityofANL-H3 2.5.2 酶最适 pH 和 pH 稳定性 考察不同 H pH 条件下脂肪酶 ANL- -3 H3 的水解活性，结果如图 4 4所示， ANL- -3 H3 的最适 H pH 为 为 7.5 ，在 pH7.0 ～0 8.0 都具有较高的活性，酶活力保持在 85% 以上。随着 pH 的进一步下降或升高，酶活力均明显下降，表明 ANL-H3 的最适 pH 范围为中性条件。
图 4pH 对黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 活性的影响 Fig.4EffectsofpHontheactivityofANL-H3 将该酶在 4℃ ，不同 H pH 条件下处理 2h ，结果如图 5 5 所示，ANL- -3 H3 在最适 H pH 下最为稳定，酶活力保持在 95% 以上；在pH6.0 ～ 8.0 ， ANL- -3 H3 的酶活力均保持在 75% 以上，具有良好的稳定性。在 pH 酸性或者强碱性条件下处理 2h，酶残留活力下降至 55%左右，结果表明该酶是一种 pH 中性酶。
图 5 黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 的 pH 稳定性 Fig.5ThepHstabilityofANL-H3 2.5.3 酶的催化底物特异性 分别以不同碳链长度脂肪酸 (C2 ～ C16) 的对硝基苯酚酯为催化底物，探究脂肪酶 ANL- -3 H3 的底物特异性。由图 6 可知，
ANL-H3 对不同碳链长度底物的水解活性不同，其中对 pNPA的催化活性最高，具有较广的底物特异性，对不同碳链长度脂肪酸酯的底物都有良好的催化活性。
图 6 黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 对 p-NP 酯的底物特异性 Fig.6SubstratespecificityofANL-H3towardspNPesters 2.5.4 金属离子对酶活力的影响 金属离子是影响酶催化性能的重要参数之一 [17] 。金属离子可以通过与酶的二硫键作用，从而改变酶的结构。考察不同金属离子对 ANL-H3 的影响，实验结果如图 7 所示。结果表明在离子浓度较低(1mmol/L)时，金属离子对脂肪酶的抑制作用不明显，其中 Mg2+、K+等有激活作用；当离子浓度为5mmol/L 时，Mn2+、Cu2+完全抑制脂肪酶的活性，酶活力只有对照组的 10%左右。Mg2+、K+等金属离子对 ANL-H3 有较明显的激活作用，可分别提高 20%～30%左右的酶活力。
图 7 金属离子对黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 活性的影响 Fig.7EffectsofmetalionsontheactivityofANL-H3 2.5.5 有机溶剂对酶活力的影响 酶催化反应可在非水相介质中进行，由于有机溶剂等非水相系 介质对催化体系 H pH 值、离子浓度及极性等性质的改变，使得酶蛋白分子在非水相介质中容易失去催化活性 [18- - 19] 。在酶催化反应体系中分别加入 5%和 10%的有机溶剂，以不加有机溶剂作为对照组。由图 8 可知，甲醇和 DMSO 对 ANL-H3
酶活力有一定的促进作用，在甲醇和 DMSO 质量分数为 10%时，酶活力分别为对照组 126.5%和 116.23%，其余 4 种溶剂对 ANL-H3 有不同程度的抑制作用。
图 8 有机溶剂对黑曲霉脂肪酶 ANL-H3 活性的影响 Fig.8EffectsoforganicsolventsontheactivityofANL-H3 2.6 黑曲霉脂肪酶的动力学参数 以 以 A pN...
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